Noor Aini Habibah dan Sri Nanan B.
Transfer Gen Penanda Pada Kentang (Solanum tuberosum L.)
CV Panda dan Atlantik dengan Bantuan Agrobacterium
Bahan dan Metode :
1. Sumber eksplan : nodus dan daun kedua sampai ketujuh yang berwarna hijau tua pada kultur pucuk kentang kultivar Panda dan Atlantik berumur 5 minggu yang dikultur secara in vitro dalam medium multiplikasi pucuk (MP).
pBI121 (Life technologies, GibcoBRL) membawa gen GUS sebagai reporter yang
diregulasi promoter CaMV 35S dan gen NPT II sebagai marker seleksi digunakan dalam
penelitian ini.
>> Plasmid pBI121 ditransfer ke dalam A. tumefaciens “disarmed” strain
LBA4404 (ElectromaxTM product) melalui metode “freeze-thaw” (Holsters et al., 1978)
yang dimodifikasi. Kultur bakteri dipelihara pada medium Yeast Extract Peptone (YEP)
dengan penambahan kanamisin 50 ppm dan rifampisin 20 ppm dan disubkultur tiap 1
bulan sekali
3. Uji Toleransi terhadap kanamisin potongan nodus dan daun yang ditanam pada medium induksi kalus (MK) dengan berbagai konsentrasi kanamisin (0, 25,50, 75, 100, 125, dan 150 ppm). Medium MK terdiri dari medium MS + 5 mg/l naftalene asetat dan 0.1 mg/l benzil adenin.
4. Tahap Transformasi
a. Persiapan Sel Bakteri
Satu koloni A. tumefaciens ditumbuhkan dalam medium YEP yang ditambah 50 mg/l
kanamisin dan 20 mg/l rifampisin “overnight” pada suhu 28(C dengan agitasi 150 rpm.
>> disubkultur dan diinkubasi sampai mencapai fase log.
b. Pengkondisian, Inokulasi dan Kokultivasi
Potongan nodus dan daun ditanam pada medium MK selama 1 hari + Kultur
Agrobacterium dalam fase log > lalu diinkubasi selama 5-10 menit.
> Setelah dikeringkan, eksplan dikokultivasi pada medium MK selama 1, 3, 5, 7 dan 9 hari. Setelah ko-kultivasi, jaringan dicuci dengan larutan amoksisilin 4 ppm . Eksplan yang telah dikokultivasi ditanam di medium seleksi (medium MK + 150 mg/l kanamisin).
5. Tahap evaluasi
a. Tahap isolasi DNA
Metode : CTAB-Doyle &Doyle (1990).
-Sebanyak 1 g kalus digerus dengan menambahkan nitrogen cair dan
larutan bufer ekstraksi (50 mM Tris-Cl pH 8 + 0,5 mM EDTA + 0,35% sorbitol + 0,1% BSA
+ 10% polyethylene glycol) 4 ml selama penggerusan pada suhu ruangan.
-Filtrat disaring melalui satu lapis Miracloth ke dalam tabung sentrifuga steril. Kemudian filtrat yang telah disaring disentrifugasi selama 5 menit (15000 g) pada mikrosentrifuga.
-Supernatan dibuang dan sisa filtrat ditambahkan ke tabung yang berisi pelet, lalu disentrifugasi lagi
selama 5 menit dan supernatan dibuang.
-Pelet diresuspensi dalam 400 μl buffer pencuci dan ditambah 100 μl sarkosil 5%, diinkubasi sekitar 15 menit pada suhu ruangan.
-Kemudian suspensi pelet ditambah 1 ml buffer CTAB (0,5 M CTAB + 1 M Tris-Cl pH 8 +
0,5 M EDTA + 5 M NaCl), dicampur dengan cara dibalik dan kemudian diinkubasi pada
suhu 55°C selama 30 menit.
-Sampel disentrifugasi selama 5 menit dan dialiquot sebanyak 700 μl dan supernatan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga.
-Kemudian supernatan ditambah dengan kloroform : isoamil alkohol (24:1), dicampur dan
disentrifugasi selama 1 menit.
-Supernatan ditransfer ke tabung baru. DNA diendapkan
dengan 1/10 volume 7,5 M ammonium asetat dan etanol 100%.
-Sampel disentrifugasi
selama 15 menit pada 4°C untuk mendapatkan pelet.
-Pelet DNA kemudian diresuspensi
dalam 50 μl buffer TE (10 mM Tris-Cl + 1 mM EDTA pH 8).
6. Polymerase Chain Reaction dan elektroforesis
a. Primer untuk amplifikasi gen NPTII adalah : F : GAG GCT ATT CGG CTA TGA CT dan R : ATT CTC GTG ATG GCA GGT TG (Lakshmi-Sita, 1998).
b. Bahan PCR : 2 μl DNA; 2 μl buffer PCR 10x; 0,1 μl
250 U AmpliTaq DNA polimerase; 2 μl untuk setiap primer; 1,6 μl untuk setiap 2,5 mM
dNTP.
c. Suhu denaturasi awal : 95°C selama 120 detik
d. Siklus : 35 siklus denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik
e. Annealing : 56°C selama 60 deti
f. Elongation : 71°C
selama 120 detik dan kemudian selama 5 menit pada suhu 71°C untuk melengkapi
pemanjangan
- Ajeng Ayu Suryani / 1600017100
- Nita Yuniar N / 1600017101